植物過氧化物酶POD活性測定試劑盒（微板法）
Plant Peroxidase Activity Assay Kit（Microplate Method） Ver.751165-1.0
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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PD1050M
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植物過氧化物酶POD活性測定試劑盒（微板法）
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100次
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● 產(chǎn)品組成：
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組分貨號
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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PD1050M-01
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提取緩沖液
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110 ml
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4℃
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PD1050M-02
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試劑1-顯色劑
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5 ml
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4℃，避光
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PD1050M-03
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試劑2-分析緩沖液
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15 ml
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4℃
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PD1050M-04
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試劑3-酶底物
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1.2 ml
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4℃，避光
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● 產(chǎn)品簡介：
過氧化物酶（Peroxidase，POD）是一種活性較高、廣泛存在于植物組織器官中的氧化還原酶，以鐵卟啉為輔基，能催化過氧化氫（H2O2）直接氧化酚類或胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用，有效防止過氧化氫在體內(nèi)的積累，從而對植物體起到保護作用；同時，過氧化物酶能使植物組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素,是細胞木質(zhì)素合成途徑中間的關(guān)鍵酶。所以，POD與植物體內(nèi)物質(zhì)代謝及抗逆性都有著密切關(guān)系。
測定原理：用愈創(chuàng)木酚（即鄰甲氧基酚，Guaiacol）為過氧化物酶的底物，在過氧化物酶催化下，過氧化氫可將愈創(chuàng)木酚氧化成紅棕色的4-鄰甲氧基苯酚，該物質(zhì)在470 nm處有最大吸收，故可通過測470 nm下吸光值變化測定過氧化物酶活性。
該試劑盒使用酶標儀，用酶標板測定植物樣品中的POD活性，以每次提取使用1 ml提取液，200 μl反應體系計算，該產(chǎn)品可以大約使用100次。
本試劑盒適用于檢測植物組織中的過氧化物酶(POD)活力，不推薦用于動物組織、動物細胞、細菌以及血清樣品中POD的檢測。
● 貯存、運輸及效期：
4℃貯存；常溫運輸；有效期6個月。
● 自備材料：
植物材料；剪刀；研缽；酶標儀（最佳檢測波長470 nm）；酶標板；低溫臺式離心機；可調(diào)式移液器；蒸餾水等。
● 實驗準備：
1. 酶標儀預熱30 min，設定波長到470 nm。
2. 測定前提前30 min取出試劑1、 試劑2和試劑3，平衡至常溫（25℃）。
3. 提前打開制冰機。
● 操作步驟：
建議正式實驗前，選取2個樣本做預測定，了解實驗樣品情況，熟悉流程，避免樣本和試劑浪費。
一. 樣本POD提?。?/b>
1.1 取新鮮植物組織，按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（ml）為~1：10的比例用研缽進行冰浴研磨，制備成~10%植物勻漿液，如0.1 g 植物葉片，加入1 ml提取液，用研缽進行冰浴研磨。
注：如果提高研磨效率，可加入適量石英砂（試劑盒不提供，自備）輔助研磨。
1.2 12000 rpm，4℃離心10 min，取上清，即為含有POD的樣本，置冰上測定。
注：提取的樣本如需貯存，建議按需分裝后-80℃貯存，兩周內(nèi)使用，盡量避免反復凍融。
二. 樣本測定：
2.1 酶標儀程序設置：
確定使用470
nm波長檢測；如果酶標儀可以間隔采集吸光值，設定檢測程序每1 min讀數(shù)一次，設定多次讀數(shù)（一般可以設定10次，時間總長10 min）；如果酶標儀無此功能，記錄初始吸光值和終止時間的吸光值。
2.2 在酶標板中依次加入：
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加入順序
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試劑名稱
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加入體積（μl）
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反應總體積 200 μl
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1
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樣本
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10
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2
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試劑1-顯色劑
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40
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3
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試劑2-分析緩沖液
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140
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4
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試劑3-酶底物
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10
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混勻后，立即在 470 nm處讀取吸光值 A1以及反應時間后的吸光值A2，△A=A2-A1
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2.3 由于植物樣本繁多，不同物種的POD活性差異很大，有的物種活性很高（反應啟動后混合液顏色很快由橘黃色變?yōu)榧t褐色）；有的物種活性很低（反應啟動后 5 分鐘內(nèi)混合液不變色），吸光值只有小數(shù)點后三位的變化。強烈建議先取 2-3 個樣本做個預測定，如果反應啟動后混合液顏色很快由橘黃色變成紅褐色，A1值大于0.6 或
A2 值大于1.5 或ΔA大于1，說明酶活性過高，可降低樣本量 V1（如減至 5 μl， 則試劑2相應增加5
μl），改變后的 V1 需代入公式重新計算，也可將樣本的提取上清液用提取液稀釋 5-10倍后重新檢測，計算公式中要乘以相應的稀釋倍數(shù)（D）。如果
A1 值很小（＜0.05），且△A 很?。ǎ?.005），且反應啟動后一段時間沒有顯色（一般5 min內(nèi)），說明酶活性很低，可增加樣本量 V1（如增至 20
μl，則試劑2相應減少10
μl），或可延長反應時間 T（如延長到 5 min 后讀取
A2），改變后的 V1 和 T 需代入公式重新計算。
2.4 若吸光值的上升趨勢不穩(wěn)定，可全部加完所有試劑后讀取各個時間點的吸光值，根據(jù)時間對
吸光值的線性回歸曲線，選取一段線性增長范圍讀取△A值（參見實驗示例）。
2.5 若檢測體系不變，可按照樣本檢測數(shù)量，預先把試劑1，試劑2和試劑3按照
40:140:10 比例配成所需體積的混合液，在加樣表中直接加一槍 190 μl 混合液即可。
三. 活性計算：
3.1 按樣本鮮重（FW）計算：
酶活定義：每克植物組織鮮重（FW）每分鐘在200 μl反應體系中使470 nm 處吸光值增加1為一個酶活力單位U。
計算公式：POD（U/g FW）＝ΔA÷(FW×V1÷V)÷T×D
3.2 按樣本蛋白濃度計算：
注：此方法需要測定提取液的蛋白濃度，推薦使用BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號:RTP7102）。
酶活定義：每毫克蛋白（mg prot）每分鐘在200 μl反應體系中使 470 nm 處吸光值增加1為一個酶活力單位 U。
計算公式：POD（U/mg prot） ＝ΔA÷(V1×Cpr)÷T×D
注解：
V：步驟1.1中加入提取液體積（μl）
V1：步驟2.2中加入樣本的體積（μl）
T：步驟2.2讀取兩次A470的間隔反應時間（min）
FW：步驟1.1中樣本鮮重質(zhì)量（g）
Cpr：步驟3.2中，樣本蛋白濃度（mg/ml）
D：步驟2.3中，如果酶活性過高，需要稀釋的倍數(shù)，未稀釋即為1
四. 實驗示例：
取0.5 克綠蘿葉片，加入5 ml提取液冰浴勻漿，制成10%勻漿液，12000 rpm 4℃離心10 min，取上清置于冰上，按照測定步驟操作，三個復孔，設定酶標儀檢測波長470 nm，間隔1 min采集數(shù)據(jù)，采集10次；時間對吸光值做線性回歸曲線，4-6 min線性較好，2 min內(nèi)△A=0.225-0.130=0.095。
計算POD（U/g FW）=0.095÷（0.5×10÷5000）÷2×1=47.5 U/g FW
4.2 綠蘿POD活性測定-按樣本蛋白濃度計算：
取0.5 克綠蘿葉片，加入5 ml提取液冰浴勻漿，制成10%勻漿液，12000 rpm 4℃離心10 min，取上清置于冰上，BCA蛋白定量試劑盒（貨號：RTP7102）測定蛋白濃度為2 mg/ml；按照測定步驟操作，2個復孔，設定酶標儀檢測波長470 nm，間隔1 min采集數(shù)據(jù)，采集10次；時間對吸光值做線性回歸曲線，4-6 min線性較好，2 min內(nèi)△A=0.206-0.140=0.066。酶活定義： 每毫克蛋白（mg prot）每分鐘在200 μl反應體系中使 470 nm 處吸光值增加0.001為一個酶活力單位 U。計算公式：POD（U/mg prot）＝ΔA÷(V1×Cpr)÷T÷0.001×D；POD（U/mg prot）=0.066÷（10×2）÷2÷0.001×1=1.65 U/mg prot。
